基础知识——病毒学研究工具-假病毒（Pseudovirus）

病毒是一种由遗传物质和蛋白质构成的简单生物体，尽管其结构和功能有限，却能引发严重疾病，导致生命损失和经济破坏。病毒通过宿主细胞的受体和表面蛋白结合，随后融合进入宿主细胞内部。病毒的遗传物质在细胞内被释放和处理，进而通过“劫持”基因转录和蛋白质翻译机制实现自身的复制。为了深入理解病毒与宿主细胞之间的相互作用，以及病毒传播和组装的机制，科学家们开发了专门的生物化学工具，包括重组病毒蛋白、抗体和假病毒颗粒等。这些工具有助于病毒学研究，为病毒诊断、公共卫生干预和抗病毒疗法的研发奠定基础。

假病毒，作为一类有用的工具，特别适用于评估病毒突变对抗体效力的影响。由于RNA病毒具有高频诱变的特性，这些病毒能够迅速适应新的免疫环境，特别是当突变影响关键表位时，可能会显著降低抗体的中和能力。构建突变蛋白库有助于研究这些突变的影响，但突变蛋白的行为与病毒的整体生物学行为并不直接相关。因此，假病毒通过将感兴趣的蛋白质工程化到病毒颗粒表面，使得病毒结合宿主细胞后，报告基因能够被封装和激活，从而提供了一种评估病毒突变生物学影响的手段。这种测定通常以荧光强度的形式呈现，有助于评估病毒的毒力和突变对病毒行为的影响。

《Nature Protocol》上发表的一篇文章详细介绍了如何利用假病毒检测新冠病毒中和能力的方法。SARS-CoV-2是一种单链正义RNA病毒，属于β冠状病毒科，是已知的最大的RNA病毒之一。其基因组主要编码非结构基因和四种结构蛋白，其中S蛋白是病毒进入细胞的主要蛋白，也是诱发免疫系统产生中和抗体的主要目标。SARS-CoV-2假病毒通过VSV假病毒包装系统制备，该系统此前已被用于生成多种假病毒，如埃博拉病毒、尼帕病毒、汉坦病毒、Lyssavirus和裂谷热病毒。SARS-CoV-2假病毒的主干来自VSV病毒，其中G基因被荧光素酶(Fluc)报告基因取代，而SARS-CoV-2的S蛋白则被合并到VSV假病毒表面的膜蛋白上。

在制备假病毒的过程中，首先将SARS-CoV-2 S蛋白表达质粒转染到293T细胞中，以表达全长S蛋白并固定在细胞膜上。接着，细胞被VSV G假病毒(G*ΔG-VSV)感染，该病毒利用其表面的VSV G蛋白进入细胞，并提供有缺陷的VSV基因组。感染后，未被包膜的ΔG-VSV基因组表达VSV基因组中除G蛋白外的酶和结构蛋白，并完成基因组复制。通过这一过程，表达的缺陷基因组组装成无包膜的病毒颗粒，病毒通过出芽释放。在这个过程中，细胞表面表达的SARS-CoV-2 S蛋白被固定在VSV颗粒的膜上，成为伪病毒粒子的包膜蛋白。因此，SARS-CoV-2假病毒包装有缺陷的VSV基因组，其中G蛋白表达基因被编码Fluc的基因取代。这些伪病毒粒子膜上含有S蛋白，具备SARS-CoV-2感染的特征。

当假病毒与含有SARS-CoV-2受体的细胞孵育时，假病毒会附着并穿透细胞表面的受体进入细胞。经过分离活病毒Huh-7和Vero细胞，SARS-CoV-2假病毒能够有效感染细胞。进入细胞的假病毒将表达除G蛋白外的所有VSV蛋白，这些结构蛋白将组装成包裹有缺陷VSV基因组的衣壳。然而，由于在这个过程中没有表面蛋白的表达，这些病毒颗粒无法形成含有表面蛋白的完整病毒颗粒，因此不能进行连续复制，只能发生单轮感染。VSV基因组不仅表达自身的蛋白，还表达报告基因Fluc，加入底物后即可检测到荧光信号，从而量化进入靶细胞的假病毒数量。

在假病毒的包装过程中，首先需要制备两个质粒：pcDNA3.1.VSVG和pcDNA3.1.S2。前者用于扩增VSV病毒载体G*ΔG-VSV，后者用于将SARS-CoV-2 S蛋白传递到细胞表面。为了扩增G*ΔG-VSV，需用含有G蛋白基因缺陷的G*ΔG-VSV原液感染细胞，并同时转染质粒pcDNA3.1。通过优化S基因在哺乳动物细胞中的表达效率，可以提高SARS-CoV-2 S蛋白的表达效果，从而增强其在细胞表面的展示。

包装假病毒的具体步骤包括细胞转染和假病毒的产生。通过转染SARS-CoV-2 S质粒在细胞表面提供膜蛋白，G*ΔG-VSV感染提供VSV基因组，制备SARS-CoV-2假病毒。在感染后24小时收集细胞上清，进行后续处理以获得假病毒。通过稀释和化学发光检测，可以评估进入靶细胞的假病毒数量，从而确定样品中和抗体的含量。利用这些方法，可以在96孔板中同时检测多个样本的中和能力。

为了实现病毒包装和中和实验的高效和精确操作，实验步骤需要严格遵循特定的协议。这包括使用低内毒素质粒提取盒提取pcDNA3.1.VSVG和pcDNA3.1.S2质粒，以及在37°C预热的环境中进行细胞培养、转染、病毒包装和中和实验的各阶段操作。通过精确控制温度、培养时间、试剂处理等参数，确保实验的可靠性和可重复性，从而为病毒学研究和抗病毒疗法的开发提供关键的科学依据。